مقدمه                ۱
ارگانیسمها و روابط همزیستی در تثبیت ازت       ۴
آلی‌پرورهای آزادزی          ۶
نورپرورهای آزادزی          ۹
دی‌آزوتروفهای همیار گندمیان     ۱۳
لگومها              ۱۵
همزیستی های اکتینوریزی     ۲۰
همزیستی های نورپروری        ۲۴
عامل ژنتیکی کنترل کننده    ۲۹
عوامل محیطی           ۳۳
اولین مرحله تثبیت ازت به روش همزیستی         ۳۹
آلودگی ریشه‌های لگوم توسط ریزوبیوم          ۴۳
فرآیند بیوشیمیایی تثبیت ازت             ۴۸
منابع                ۵۳
منابع:

الدرا،پال. فرانسیس ای،کلارک. میکروبیولوژی وبیوشیمی خاک.۱۳۷۶٫ ترجمه:  علی‌اصغرزاده, ناصر. انتشارات دانشگاه تبریز. ۴۲۵ص.
تایزوزایگر. فیزیولوژی گیاهی. ۱۳۷۹٫ جلددوم. ترجمه: محمدکافی  وهمکاران. انتشارات جهاد دانشگاهی مشهد. ۳۷۹ص.
فرانکلین پی.گاردنر. آر. برنت پی یرس. راجر ال. میشل.  فیزیولوژی گیاهان زراعی. ۱۳۷۹٫ ترجمه:کوچکی، عوض و غلامحسین سرمدنیا. ۴۰۰ص.

Sharma. A. k. 2002. Biofertilizers For sustainable agriculture. Agrobios india. PP. 156-192.
مقدمه

ازت به عنوان یک عنصر کلیدی در ساختمان بسیاری از ترکیبات موجود در سلولهای گیاهی مطرح است. این عنصردر فسفونوکلئوتید و اسیدهای آمینه هم وجود دارد که این ترکیبات نیز به نوبة خود به ترتیب اسیدهای نوکلئیک و پروتئینها را می‌سازند. دسترسی به ازت برای گیاهان زراعی از عوامل مهمّ محدود‌کنندة تولیدات کشاورزی است. این واقعیت که فقط اکسیژن، کربن و هیدروژن بیش از ازت در سلولهای گیاهی وجود دارند، مبیّن اهمیّت این عنصراست.

در بیوسفر، ازت به اشکال متفاوتی وجود دارد. ۷۸% حجم هوای اتمسفر را ازت ملکولی (N2) تشکیل می‌دهد. در بسیاری از موارد این مقدار فراوان ازت مستقیماً در دسترس گیاهان قرار نمی‌گیرد. استفاده از ازت اتمسفر، مستلزم  شکستن پیوند سه‌گانه بین اتمهای (N = N) آن است که گیاهان عالی مستقیماً و به تنهایی توان انجام این واکنش را ندارند. از سوی دیگر اشکال نیتراته و آمونیاکی ازت به راحتی جذب گیاه می‌گردند(فصل ۵). مصرف گیاهان توسط حیوانات علفخوار موجب حرکت بیشتر ازت در زنجیره‌های غذایی می‌شود و ازت سرانجام از طریق تجزیة اجساد حیوانات و گیاهان به زمین بازمی‌گردد. این مراحل بخشی از چرخة ازت را تشکیل می‌دهند.

تبدیل ازت مولکولی به اشکال دیگر آن نظیر نیترات یا آمونیاک را تثبیت ازت می‌گویند. این فرایند در غالب فرایندهای طبیعی و مصنوعی قابل انجام است. درشرایط دمای بالا (حدود C ْ۲۰۰ ) و فشار بالا حدود (۲۰۰ اتمسفر)، ازت مولکولی با هیدروژن ترکیب شده و آمونیاک (NH3) تولید می‌شود. برای انجام این واکنش شرایط خاصی لازم است تا برای انرژی فعّال بالای آن غلبه کند. این واکنش که به نام فرایند هابر موسوم است نقطة آغازین در تولیدات متنوع صنعتی و کشاورزی به شمار می‌آید. در جهان سالانه حدود ۵۰ میلیون تن ازت به روش صنعتی تثبیت می‌گردد.

این مقدار حدود ۱۲% از کلّ ذخیرة اتمسفر را شامل می‌شود که سالنه از آن خارج می‌شود (شکل ۲-۱۲، ب) (مارشنر، ۱۹۸۶). فرایند های طبیعی سهم بیشتری در تثبیت ازت دارند (وسویچ، ۱۹۸۳). ۱۰% ازکلّ ازتی که به روش طبیعی تثبیت می‌گردد، ناشی از رعدو برق است. رعدو برق سبب می‌شود که رادیکالهای آزاد هیدروکسیل، اتمهای آزاد هیدروژن، اتمهای آزاد اکسیژن حاصل از بخار آب و اکسیژن موجود در اتمسفر و ترکیباتی فعالی از این قبیل، با نیتروژن مولکولی ترکیب شده و تولید اسید نیتریک (HNO3) نمایند، که این ترکیب نیز توسط آب باران به زمین می‌رسد. بخش بسیار کوچکی از تثبیت ازت ناشی از واکنشهای فتوشیمیایی با دخالت اکسید نیتریت گازی و اُزن در استراتوسفر است. اسید نیتریکی که به این ترتیب تولید می‌شود سرانجام به بخشهای پایینتر اتمسفر راه یافته واز آنجا نیز توسط باران به زمین می‌رسد.

۹۰% باقیماندة تثبیت ازت، به روش طبیعی و توسط میکروارگانیسم ها و از طریق فرایندی که اصطلاحاً تثبیت بیولوژیکی ازت نامیده می‌شود انجام می‌شود (شکل ۱-۱۲، ب). تثبیت بیولوژیکی ازت توسط باکتریهای آزادزی شامل سیانو باکتریها و باکتریهای همزیست با گیاهان انجام می‌گیرد (بوریس، ۱۹۷۶؛ مارشنر، ۱۹۸۶). این موجودات دارای یک سیستم آنزیمی هستند که قادر است ازت مولکولی را تجزیه کند. از نقطه نظر کشاورزی نیز تثبیت بیولوژیکی ازت اهمیت زیادی داشته و منبع مهمی برای ازت خاک محسوب می‌گردد، چرا که نیاز گیاهان زراعی صرفاً از طریق کودهای شیمیایی تأمین نمی‌گردد (شوبرت و ولک، ۱۹۸۲).

واکنشهای چرخه ازت که نهایتاً سبب تثبیت آن می‌گردند، شامل تغییر اشکال تثبیت شده و بازگشت ازت به اتمسفر نیز می‌گردد. اشکال آلی ازت نظیر اسیدهای آمینه که از طریق تجزیه بقایای گیاهی و حیوانی به خاک برمی‌گردند، طیّ فرایند آمونیاکی شدن به آمونیاک تبدیل می‌گردند. باکتریها و قارچهای موجود در خاک ازت آمونیاکی را به آمونیاک آزاد تبدیل می‌کنند.

این نیز به نوبة خود می‌تواند با اجزای موجود در خاک ترکیب شده و نمکهای آمونیومی تولید کند، همچنین آمونیاک آزاد شده می‌تواند در ابتدا به نیتریت (NO2-) وسپس به نیترات (NO3-)  اکسید شود که این فرایند را نیتریفیکاسیون گویند. اکسیداسیون آمونیاک به نیتریت توسط باکتریهای گروه نیتروزو (نیتروزوموناس) انجام می‌شود در حالی که اکسیداسیون نیتریت به نیترات بیشتر توسط باکتریهای گروه نیترو (نیتروباکتر) انجام می‌پذیرد.

نیتروژن موجود در خاک به فرم نیتراتی می‌تواند به سرعت جذب گیاه گردد یا طیّ فرایند دنیتریفیکاسیون احیا شده و به صورت ازت مولکولی (N2) به اتمسفر باز گردد. بسیاری از باکتریها در غیاب اکسیژن و با وجود ترکیباتی چون NO3-، NO2-و یا N2O از دنیتریفیکاسیون به عنوان منبعی برای تأمین انرژی تنفسی استفاده می‌کنند (بیورز، ۱۹۷۶).

دنیتریفیکاسیون فرایند بیولوژیکی مهمی به شمار می‌آید. زیرا در غیاب این فرایند نیترات به سرعت در اقیانوسها انباشته خواهد شد.  علاوه براین وقتی میزان ازت تثبیت شده در یک سال را (۱۲۵ میلیون تن) با میزان ازت برگشتی به اتمسفر از طریق  دنیتریفیکاسیون (۹۳میلیون تن) مقایسه می‌کنیم باز هم مقداری ازت به عنوان مانده داریم (دلویچ،۱۹۸۳). این یافته نشان می‌دهد که این میزان مازاد ازت تثبیت شده همان مقداری است که به آرامی در خاک، دریاچه‌ها و اقیانوسها انباشته می‌گردد.
ارگانیسمها و روابط همزیستی در تثبیت ازت

بیش از ۲۰۰۰سال قبل در نوشتجات رومیان به اثرات مفید گیاهان لگوم اشاره شده است. نویسندگان چینی طی همان دوره دربارة اثرات مفید کاربرد سرخس آبزی (آزولا) در کشت برنج مطالبی نوشته اند. کتابی دربارة تکنیکهای کشاورزی تحت عنوان « فنون تغذیة مردم»
(Child Min Tao – shu) که ۵۴۰ سال پس از میلاد مسیح نوشته شده، کشت و کاربرد آزولا را در مزارع برنج توضیح می‌دهد. اروپای غربی با کاربرد لگوم‌ها در تناوب سبب پایداری کشاورزی شده و امکان صنعتی شدن را فراهم آورد. آقای هامفری دیوی در سال ۱۸۱۳ اولین فردی بود که عنوان نمود: نیتروژن ( ازت) از اتمسفر گرفته می‌شود. او نوشت « به نظر می‌رسد که لوبیا و نخود، خاک را برای کشت گندم مساعد می‌کنند» .جی. بی. بوسینگالت در مطالعات تناوب زراعی خود در فرانسه، یک سری مقاله از سال ۱۸۳۷ تا ۱۸۴۲ انتشار داده ودر آنها اصول ورود ازت بوسیلة لگوم‌ها را بنا نهاد. آلبرت تیئر در سال ۱۸۵۶ در آلمان نوشت: « اخیراً کاشت شبدر سفید با محصول بعدی، بسیار معمول شده است. فقط تعداد بسیار کمی از کشاورزان بی‌تفاوت و تنبل یا افرادی که سخت طرفدار نظریات خود و سنتها هستند، این عمل را انجام نمی‌دهند».

اهمیت غده‌ها در تثبیت ازت بصورت همزیستی توسط هلریژل و ویلفارت در سال ۱۸۸۶ توضیح داده شد. بیجرینک در سال ۱۸۸۸ ارگانیسمهای تثبیت کنندة N2 در لگومها را جداسازی کرده و آنها را باسیلوس رادیسکولا نام نهاد. این باکتریها بعداً ریزوبیوم نامگذاری شدند. جنس کلاستریدیوم که باکتری تثبیت کنندة ازت غیر همزیست می‌باشد در سال ۱۸۹۰ توسط وینوگرادسکی جداسازی شد و ازتوباکتر که هوازی می‌باشد در سال ۱۹۰۱توسط بیرجینک معرفی گردید. تا پایان این قرن، تقریباً تمام میکروارگانیسمهای تثبیت کنندة ازت شناسائی شده بودند.

گروههای متنوعی از هسته دارها دارای آنزیم نیتروژناز (مسئول تثبیت N2)هستند. این باکتریها امروزه دی‌آزوترف نامیده می‌شوند و شامل باکتریهای آلی‌پرور، باکتریهای  نورپرورگوگردی وسیانوباکترها (جلبک سبز- آبی) می‌باشند. (جدول)
آلی‌پرورهای آزادزی

نمونه‌ای از باکتریهای آزاد هوازی و تثبیت‌کنندة ازت که از مواد آلی بعنوان منبع انرژی استفاده می‌کنند ازتوباکترها می‌باشند ودر خاکهای خنثی و قلیائی یافت می‌شوند. باکتریهای مشابه آن نظیر بیجرینکیا و در‌کسیا محدودة وسیعی از PH‌ را تحمل می‌کنند واغلب در خاکهای اسیدی مخصوصاً مناطق گرمسیری یافت می‌شوند. تجزیة ژنتیکی نشان می‌دهد که شباهت بیجرینکیا به آزوسیپریلوم (باکتری تثبیت کنندة ازت)بیشتر از ازتوباکتراست. این ارگانیسمها، همچنین جنس کلبسیلا (تثبیت کنندة ازت) درمحیطها‌ی مرطوب بر روی برگ یا در پوشش برگ (فیلوسفر) ونیز در خاک و سطح ریشه فعالیت می‌کنند.

ازتوباکتر، بیجرینکیا و ریزوبیوم برای تولید انرژی موردنیاز در تثبیت N2  ، به شرایط هوازی نیاز دارند. معذالک در این ارگانیسمها و دیگر دی‌آزوتروفها، فعالیت آنزیم نیتروژناز درحضور O2 محدود می‌گردد. مکانیسمهای اختصاصی برای حفاظت نیتروژناز شامل قرار‌گرفتن باکتری در داخل یاخته و احاطه شدن آن بوسیلة چندین غشاء می‌باشد. تولید مواد لزج بوسیلة یاخته ها نیز یک مکانیسم حفاظتی است که در نتیجة این عمل، انتشار O2به طرف آنزیم کاهش می‌یابد.

خصوصیت دیگر باکتریهای هوازی تثبیت کنندة ازت، تنفس شدید در داخل یاخته خود باکتری است. این عمل در ازتوباکتر به کاهش غلظت O2 در داخل باکتری کمک می‌کند. تصور بر این است که آنزیم نیتروژناز در حضور O2 جهت سازگاری با آن، تغییر ساختمان داده ولی قادر به تثبیت ازت نخواهد بود. این تغییر برگشت پذیر بوده ودر صورتیکه O2 به مدت طولانی داخل باکتری حضور نداشته باشد، این آنزیم به حالت تثبیت ازت برمی‌گردد .

ارگانیسمهای میکروهوازی اختیاری نظیر کلبسیلا، آزوسیپریلوم و باسیلوس در محیطهائی که نیاز به جلوگیری از O2 وجود ندارد، انرژی خود را به فرم ATP توسط مسیر اکسیداتیو تولید می‌کنند. دی‌آزوتروفهای بی‌هوازی نظیر کلاستریدیوم و احیا کننده های سولفات شامل دسولفوویبریو و دسولفوتوماکولوم نیز از ترکیبات آلی به عنوان دهندة الکترون استفاده می‌کنند. با وجود این، مسیر تخمیری این ارگانیسمها منجر به تشکیل موادآلی حدواسط شده و انرژی کمی برای تثبیت ازت، قابل دسترس خواهد بود. برخی شرایط محیطی هم وجود دارند که مواد اولیه قابل دسترس در آن زیاد بوده و شرایط بی‌هوازی هم حاکم است (نظیر ماندابها) که در این حالت مقادیر قابل توجهی N2توسط این ارگانیسمها تثبیت می‌شود. شرایط بیهوازی، توانائی کسب انرژی از اکسیداسیون مواد اولیه را کاهش می‌دهد. شرایط بیهوازی، همچنین رقابت استفاده از این مواد اولیه را به وسیلة ارگانیسمهای دیگر نظیر باکتریها و قارچهای هوازی، کاهش می‌دهد. مقدار ازت تثبیت شده بوسیلة دی‌آزتروفهای آزادزی و ارگانیسمهای فیلوسفری، عموماً چند کیلو‌گرم در هکتار می‌باشد. تحقیقات نشان می‌دهند که بدون استثناء در همة مکانها فرآیند تثبیت ازت، اگر چه مقدار آن کم باشد، صورت می‌گیرد. تأثیر دی‌آزوتروفهای آزادزی وقتی قابل ملاحظه است که در مقیاس جهانی مورد نظرقرارگیرد مخصوصاً در مناظقی که چرخة ازت در داخل خاک برقرار بوده و سرعت کم رشد گیاهان، نیاز ازتة آنها را کاهش می‌دهد .
نورپرورهای آزادزی

دریوس در سال ۱۹۸۲ نشان داد که سیانوباکتری‌ها (جلبک‌های آبی ـ سبز) ازت تثبیت می‌کنند. آنها در اکثر محیط‌های آبی حضور دارند. آنها همچنین در سطح یا درست زیر سطح اکثرخاکها مخصوصاً در نواحی که جدیداً در معرض فرسایش بوده یا تازه از آب بیرون آمده باشند، یافت می‌شوند. سیانوباکترها در اکثر محیطهای آبی نظیر شالیزارها و دریاچه‌های کوچک با مقادیر متوسطی از عناصر غذائی، دیده می‌شوند. در این مکانها گاهی می‌توانند توده هائی را بوجود آورند که تولید مواد سمی بسیار قوی (مخدر اعصاب) برای جانوران می‌کنند. آنها تنها پیش هسته‌هائی هستند که همانند گیاهان عالی مکانیسم فتوسنتزی داشته و دارای فتوسیسنم II بوده و O2  متصاعد می‌کنند ولی در محیطهای کم نور و کم اکسیژن می‌توانند زنده بمانند.

سیانوباکترهای دی‌آزوتروف آزادزی سه شکل مرفولوژیک دارند.سیانوباکترتک‌یاخته‌‌ای، گلوئوتس (قبلاً بنام گلوئوکاپسا شناخته می‌شود) ارگانیسم هوازی خاکزی و حساس به نور زیاد می‌باشد. این باکتری، نیتروژناز خود را بوسیلة مکانیسمی شبیه ازتوباکترها که در آن، آنزیم به وسیلة غشاهائی پوشیده شده، از اکسیژن تولید شده طی فتوسنتز، حفاظت می‌کند.

 توانائی تثبیت N2 مخصوصاً در سیانوباکترهای رشته ای که دارای یاخته های اختصاصی بنام هتروسیست هستند به فراوانی دیده می‌شود (شکل). هتروسیستهای با دیوارة ضخیم که در طول رشته از هر ۱۵-۱۰ یاخته بوجود می‌آیند، آنزیم نیتروژناز خود را در مقابل صدمات O2 بوسیلة مکانیسم فیزیکی با ایجاد غشاهائی که انتشار گازها را کاهش می‌دهد، حفاظت می‌کند. فقدان فتوسیستم II (سیستم فتوسنتزی تولید‌کنندة O2) در هتروسیستها به حفاظت این آنزیم کمک می‌کند. جنس نوستوک که نمونه ای از انواع رشته ای هتروسیست دار می‌باشد، بصورت پوسته ای در بسیاری از مراتع و خاکهای بیابانی دیده می‌شود. این پوسته ممکن است به مدت طولانی خشک شده ولی در اثر بارندگی های کوتاه مدت یا شبنم صبحگاهی، مرطوب و فعال شده و تثبیت N2 انجام دهد. این پوسته نیاز به کلسیم دارد لذا خاکهای آهکی را ترجیح می‌دهند، همچنین اغلب به فسفر معدنی اعم از کود فسفری تولید شده طی آتش سوزی، پاسخ می‌دهند. سومین نوع مرفولوژیک شامل سیانوباکترهای رشته ای بدون هتروسیست بنام پلکتونما می‌باشد.

شالیزارها بهترین محل برای مطالعة سیانوباکترها هستند که در آنها آنابنا، گلئوتریچیا و سیتونما دیده می‌شوند. این ارگانیسمها با کاشت دراز مدت برنج طی هزاران سال استقرار پیدا کرده اند. تحت همچون شرایطی اندازه گیری مقدار تثبیت ازت شامل آلی‌پرورهای آزادزی و نورپرورهای آزادزی می‌باشد.

همانند تمامی اندازه گیریهای تثبیت ازت، مقدار تثبیت شده بستگی به شرایط محیطی نظیر رطوبت، عناصر قابل جذب و دوره ای که تثبیت ازت بطور مؤثر صورت می‌گیرد، دارد. برآوردهائی از مقدار تثبیت ازت بطور متوسط ۳۰کیلوگرم در هکتار و سال بوده و گاهی تا year -1  Kg ha -1 70دیده می‌شود.

باکتریهای نورپرور تثبیت کنندة ازت به غیر از سیانوباکترها نیز وجود دارند که آبزی بوده ودر دریاها و آبهای شیرین زندگی کرده اما در آنها، H2O طی فتوسنتز به عنوان دهندة الکترون عمل نمی‌کند و O2نیز تولید نمی‌شود. دهندة الکترون در اینها H2S وS می‌باشند. این ارگانیسمها اگر چه مرفولوژی متنوعی دارند (جدول) ولی در راستة سودومونادال قرارمی‌گیرند. در آنها اغلب در حد فاصل رسوبات کف دریاچه ها و آب یافت می‌شوند، جائی که پتانسیل رداکس پائین بوده، ترکیبات گوگردی احیا شده وجود داشته و نور می‌تواند در آن نفوذ کند.

باکتریهای سبز گوگردی و ارغوانی گوگردی، فتولیتوتروف بوده که با استفاده از H2S بعنوان دهندة الکترون، CO2 را در حضور نور احیا می‌کنند. باکتریهای ارغوانی گوگردی (رودوسپیریلوم) طی عمل فتوسنتز به ترکیبات آلی بعنوان دهندة الکترون نیاز دارند و نورآلی‌پرور هستند. این ارگانیسمها همچنین می‌توانند ترکیبات آلی را بعنوان منبع انرژی بکاربرند. اگر چه فتوسنتز آنها بایستی در شرایط بی‌هوازی انجام گیرد ولی می‌توانند در شرایط هوازی بصورت شیمی آلی‌پرور عمل کنند. اهمیت آنها در تثبیت ازت وقتی قابل ملاحظه می‌گردد که بصورت تودة متراکم رشد کنند.